非特異染色的原因包括一抗和二抗與血清蛋白的相互作用，抗體與組織之間的離子相互作用，以及與能夠影響IHC檢測系統(tǒng)的內(nèi)源分子的相互作用。這些問題會產(chǎn)生高背景，以及無法在適當?shù)募毎恢糜^察目的抗原。這種類型的染色問題可通過用封閉劑來封閉非特異相互作用來解決。在將樣本與一抗共同孵育之前，可開展這些步驟

預防非特異疏水相互作用

盡管疏水相互作用在抗原表位-抗體的結合中起了重要作用，但這些力同樣能促進非特異結合。由于一些氨基酸的中性側鏈，大部分蛋白有著某種程度的疏水性。將組織與熱滅活的正常血清或牛血清白蛋白（BSA）共同孵育，是降低非特異疏水結合的常用步驟。正常血清類型的選擇對預防與一抗或二抗的相互作用，或預防與待染色組織/細胞的相互作用很重要。例如，在使用山羊來源的一抗時，不建議用山羊血清作為封閉劑。而是推薦與二抗的宿主動物相同的血清或來自不相關物種的血清。BSA和脫脂奶粉常用作封閉劑。這些試劑通常包含在一抗和二抗的稀釋液中。非離子去污劑如0.3% Triton X-100?或Tween 20?的添加也能降低非特異疏水相互作用。

預防非特異離子相互作用

如果使用的抗體與目的組織有著相反的凈電荷，那么離子相互作用可能導致非特異的背景染色。例如，非特異染色可能來自相反的羧基和氨基相互作用。范德華力、兩級分子間的弱靜電相互作用也能起作用。增加固定劑和/或抗體稀釋液的離子強度能降低離子相互作用。不過，表位-抗體結合通常依賴于離子強度，因此這種方法也可能負面影響染色特異性。由于單克隆抗體的單表位特異性，與多克隆抗體相比，增加離子強度更可能損害其性能。

內(nèi)源酶的干擾

顯色檢測法常使用一種結合的酶來觀察表位-抗體的相互作用。在使用這種檢測方法時，同一種酶的內(nèi)源活性必須被封閉。例如，包含辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）的操作步驟可能需要試劑來防止非特異信號。腎、肝或帶有紅細胞的血管區(qū)域等組織含有內(nèi)源的過氧化物酶活性。由3-10% H2O2配制而成的過氧化物酶封閉液能用于防止內(nèi)源的過氧化物酶切割底物。